ସମ୍ବାଦ

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) β- ଗାଲାକ୍ଟୋସିଡେଜ୍ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ର ଏକ ଅନୁରୂପ, ଯାହା ଅତ୍ୟଧିକ ଅନୁପଯୁକ୍ତ |ଆଇପିଟିଜିର ଅନୁକ୍ରମଣିକା ଅନୁଯାୟୀ, ପ୍ରବର୍ତ୍ତକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସହିତ ଏକ ଜଟିଳତା ସୃଷ୍ଟି କରିପାରିବ, ଯାହା ଦ୍ the ାରା ଦମନକାରୀ ପ୍ରୋଟିନ୍ ର ରୂପାନ୍ତର ପରିବର୍ତ୍ତନ ହେବ, ଯାହା ଦ୍ target ାରା ଏହା ଲକ୍ଷ୍ୟ ଜିନ୍ ସହିତ ମିଳିତ ହୋଇପାରିବ ନାହିଁ ଏବଂ ଟାର୍ଗେଟ୍ ଜିନ୍ ଦକ୍ଷତାର ସହିତ ପ୍ରକାଶ ପାଇବ |ତେବେ ପରୀକ୍ଷଣ ସମୟରେ IPTG ର ଏକାଗ୍ରତା କିପରି ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯିବା ଉଚିତ୍?ବଡ ବଡ ଭଲ କି?
ପ୍ରଥମେ, ଆସନ୍ତୁ IPTG induction ର ନୀତି ବୁ understand ିବା: ଇ କୋଲିର ଲାକ୍ଟୋଜ୍ ଅପେରନ୍ (ଉପାଦାନ) ତିନୋଟି ଗଠନମୂଳକ ଜିନ୍, Z, Y, ଏବଂ A ଧାରଣ କରିଥାଏ, ଯାହା ଯଥାକ୍ରମେ β- ଗାଲାକ୍ଟୋସିଡେଜ୍, ପର୍ମିଜ୍ ଏବଂ ଆସେଟିଲଟ୍ରାନ୍ସଫ୍ରେଜ୍ ଏନକୋଡ୍ କରେ |lacZ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜ୍ ଲାକ୍ଟୋଜ୍ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଏବଂ ଗାଲାକ୍ଟୋଜ୍ କିମ୍ବା ଆଲୋ-ଲାକ୍ଟୋଜ୍ ରେ;lacY ପରିବେଶରେ ଲାକ୍ଟୋଜ୍ କୁ ସେଲ୍ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ଦେଇ ଯିବା ପାଇଁ ଅନୁମତି ଦିଏ ଏବଂ କୋଷରେ ପ୍ରବେଶ କରେ |lacA ଆସେଟିଲ୍ ଗୋଷ୍ଠୀକୁ ଆସେଟିଲ୍-କୋଏରୁ gal- ଗାଲାକ୍ଟୋସାଇଡ୍ କୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରେ, ଯାହା ବିଷାକ୍ତ ପ୍ରଭାବ ଅପସାରଣକୁ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରେ |ଏହା ସହିତ, ସେଠାରେ ଏକ ଅପରେଟିଂ କ୍ରମ O, ଏକ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ କ୍ରମ P ଏବଂ ଏକ ନିୟାମକ ଜିନ୍ I. I ଜିନ୍ କୋଡ୍ ହେଉଛି ଏକ ଦମନକାରୀ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଯାହା ଅପରେଟର୍ କ୍ରମର O ସ୍ଥିତିକୁ ବାନ୍ଧିପାରେ, ଯାହା ଦ୍ oper ାରା ଅପେରନ୍ (ମେଟା) ଦମନ କରାଯାଇଥାଏ ଏବଂ ବନ୍ଦକ୍ୟାଟାବୋଲିକ୍ ଜିନ୍ ଆକ୍ଟିଭେଟର ପ୍ରୋଟିନ୍- CAP ବାଇଣ୍ଡିଂ ସାଇଟ୍ ଅପଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ପାଇଁ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ କ୍ରମର ପି ପାଇଁ ଏକ ବାଇଣ୍ଡିଂ ସାଇଟ୍ ଅଛି | P କ୍ରମ, O କ୍ରମ ଏବଂ CAP ବାଇଣ୍ଡିଂ ସାଇଟ୍ ଏକତ୍ର ଲାକ ଅପେରନର ନିୟାମକ ଅଞ୍ଚଳ ଗଠନ କରେ |ତିନୋଟି ଏନଜାଇମର କୋଡିଂ ଜିନ୍ ସମାନ ନିୟାମକ ଅଞ୍ଚଳ ଦ୍ୱାରା ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୋଇଥାଏ ଯାହା ଜିନ୍ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକର ସମନ୍ୱିତ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ହାସଲ କରିଥାଏ |

ଲାକ୍ଟୋଜ୍ ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ, ଲାକ୍ ଅପେରନ୍ (ମେଟା) ଦମନ ଅବସ୍ଥାରେ ଅଛି |ଏହି ସମୟରେ, PI ପ୍ରୋମୋଟର୍ କ୍ରମର ନିୟନ୍ତ୍ରଣରେ I କ୍ରମ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରକାଶିତ ଲାକ୍ ଦମନକାରୀ O କ୍ରମକୁ ବାନ୍ଧେ, ଯାହା RNA ପଲିମେରେଜ୍କୁ P କ୍ରମରେ ବାନ୍ଧିବାରେ ରୋକିଥାଏ ଏବଂ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଆରମ୍ଭକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରେ |ଯେତେବେଳେ ଲାକ୍ଟୋଜ୍ ଉପସ୍ଥିତ ଥାଏ, ଲାକ ଅପେରନ୍ (ମେଟା) ପ୍ରେରିତ ହୋଇପାରେ ଏହି ଅପେରନ୍ (ମେଟା) ସିଷ୍ଟମରେ, ପ୍ରକୃତ ଇନଡୁସର ନିଜେ ଲାକ୍ଟୋଜ୍ ନୁହେଁ |ଲାକ୍ଟୋଜ୍ କୋଷରେ ପ୍ରବେଶ କରେ ଏବଂ β- ଗାଲାକ୍ଟୋସିଡେଜ୍ ଦ୍ all ାରା ଆଲାଲାକ୍ଟୋଜ୍ ରେ ରୂପାନ୍ତରିତ ହୁଏ |ପରବର୍ତ୍ତୀ, ଏକ ଅନୁକ୍ରମଣିକା ଅଣୁ ଭାବରେ, ଦମନକାରୀ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସହିତ ବାନ୍ଧେ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ରୂପାନ୍ତରଣରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରେ, ଯାହା O କ୍ରମ ଏବଂ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ରୁ ଦମନକାରୀ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ହୋଇଯାଏ |ଆଇସୋପ୍ରୋପିଲଥିଆଗାଲାକ୍ଟୋସାଇଡ୍ (ଆଇପିଟିଜି) ଆଲୋଲାକ୍ଟୋଜ୍ ସହିତ ସମାନ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ |ଏହା ଅତ୍ୟନ୍ତ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ଅନୁପ୍ରବେଶକାରୀ, ଯାହା ବ୍ୟାକ୍ଟେରିଆ ଦ୍ met ାରା ମେଟାବୋଲାଇଜ୍ ହୋଇନଥାଏ ଏବଂ ବହୁତ ସ୍ଥିର ଅଟେ, ତେଣୁ ଏହା ଲାବୋରେଟୋରୀରେ ବହୁଳ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ |

IPTG ର ସର୍ବୋଚ୍ଚ ଏକାଗ୍ରତା କିପରି ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବେ?ଏକ ଉଦାହରଣ ଭାବରେ E. coli ନିଅନ୍ତୁ |
ପଜିଟିଭ୍ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ pGEX (CGRP / msCT) ଧାରଣ କରିଥିବା ଇ.କୋଲି BL21 ଜେନେଟିକ୍ ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ ଷ୍ଟ୍ରେନ୍ LB ତରଳ ମାଧ୍ୟମରେ 50μg · mL-1 Amp ଧାରଣ କରିଥିଲା ​​ଏବଂ ରାତାରାତି 37 ° C ରେ ସଂସ୍କୃତି ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା |ସମ୍ପ୍ରସାରଣ ସଂସ୍କୃତି ପାଇଁ 1: 100 ଅନୁପାତରେ 50μg · mL-1 Amp ଧାରଣ କରିଥିବା 10m ବୋତଲରେ 50mL ତାଜା LB ତରଳ ମାଧ୍ୟମ ଉପରେ ଉପରୋକ୍ତ ସଂସ୍କୃତିକୁ ଇନୋକ୍ୟୁସନ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଯେତେବେଳେ OD600 ମୂଲ୍ୟ 0.6 ~ 0.8 ଥିଲା, IPTG ଚୂଡ଼ାନ୍ତ ଏକାଗ୍ରତାରେ ଯୋଡି ହୋଇଗଲା |ଏହା 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 ଅଟେ |ସମାନ ତାପମାତ୍ରାରେ ଏବଂ ସମାନ ସମୟରେ ଅନୁକରଣ ପରେ, ଏଥିରୁ 1 ଏମଏଲ୍ ଜୀବାଣୁ ସମାଧାନ ନିଆଗଲା, ଏବଂ ଜୀବାଣୁ କୋଷଗୁଡିକ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗେସନ୍ ଦ୍ collected ାରା ସଂଗୃହିତ ହୋଇ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ଉପରେ ବିଭିନ୍ନ IPTG ଏକାଗ୍ରତାର ପ୍ରଭାବ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବାକୁ SDS-PAGE ଅଧୀନରେ ରହିଲା | ସର୍ବ ବୃହତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ସହିତ IPTG ଏକାଗ୍ରତା ଚୟନ କରନ୍ତୁ |
ପରୀକ୍ଷଣ ପରେ, ଏହା ଦେଖାଯିବ ଯେ IPTG ର ଏକାଗ୍ରତା ଯଥାସମ୍ଭବ ବଡ଼ ନୁହେଁ |ଏହାର କାରଣ ହେଉଛି ବ୍ୟାକ୍ଟେରିଆ ପାଇଁ IPTG ର ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିଷାକ୍ତତା ଅଛି |ଏକାଗ୍ରତା ଅତିକ୍ରମ କଲେ ମଧ୍ୟ କୋଷକୁ ମାରିଦେବ;ଏବଂ ସାଧାରଣତ speaking କହିବାକୁ ଗଲେ, ଆମେ ଆଶା କରୁ ଯେ କୋଷରେ ଯେତେ ଦ୍ରବୀଭୂତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରକାଶ ପାଇବ, ସେତେ ଭଲ, କିନ୍ତୁ ଅନେକ କ୍ଷେତ୍ରରେ ଯେତେବେଳେ IPTG ର ଏକାଗ୍ରତା ଅଧିକ ଥାଏ, ସେତେବେଳେ ବହୁ ପରିମାଣର ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ ହେବ |ଶରୀର, କିନ୍ତୁ ଦ୍ରବୀଭୂତ ପ୍ରୋଟିନର ପରିମାଣ କମିଗଲା |ତେଣୁ, ସବୁଠାରୁ ଉପଯୁକ୍ତ IPTG ଏକାଗ୍ରତା ପ୍ରାୟତ the ବଡ଼ ନୁହେଁ, କିନ୍ତୁ ଏକାଗ୍ରତା କମ୍ |
ଜେନେଟିକ୍ ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ ଷ୍ଟ୍ରେନ୍ଗୁଡ଼ିକର ଉଦ୍ଭାବନ ଏବଂ ଚାଷର ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟ ହେଉଛି ଧାର୍ଯ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନର ଅମଳ ବୃଦ୍ଧି ଏବଂ ଖର୍ଚ୍ଚ ହ୍ରାସ କରିବା |ଟାର୍ଗେଟ ଜିନ୍ ର ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି କେବଳ ଷ୍ଟ୍ରେନ୍ ର ନିଜସ୍ୱ କାରକ ଏବଂ ପ୍ଲାସିମ୍ ଏକ୍ସପ୍ରେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଭାବିତ ହୁଏ ନାହିଁ, ବରଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ବାହ୍ୟ ଅବସ୍ଥା ଦ୍ୱାରା ମଧ୍ୟ ପ୍ରଭାବିତ ହୁଏ, ଯେପରି ଇନଡୁସରର ଏକାଗ୍ରତା, ଇନଡକ୍ସନ୍ ତାପମାତ୍ରା ଏବଂ ଇନଡକ୍ସନ୍ ସମୟ |ତେଣୁ, ସାଧାରଣତ ,, ଏକ ଅଜ୍ଞାତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରକାଶ ଏବଂ ଶୁଦ୍ଧ ହେବା ପୂର୍ବରୁ, ଉପଯୁକ୍ତ ଅବସ୍ଥା ବାଛିବା ଏବଂ ସର୍ବୋତ୍ତମ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଫଳାଫଳ ପାଇବା ପାଇଁ ଇନଡକ୍ସନ୍ ସମୟ, ତାପମାତ୍ରା ଏବଂ IPTG ଏକାଗ୍ରତା ଅଧ୍ୟୟନ କରିବା ସର୍ବୋତ୍ତମ |